SDS – PAGE

SDS-PAGE é a abreviatura de dodecil-sulfato de sódio (SDS) de poliacrilamida (PAGE). Essa técnica foi descrita  por Laemmli (Lammeli (1970), Nature, 277, p. 680) quando a utilizou com a finalidade de determinar a mobilidade das proteínas em gel submetido à corrente elétrica.  O SDS-PAGE consiste em  um tipo de eletroforese desnaturante em que as amostras são desnaturadas pelo calor na presença de desnaturantes (beta-mercaptoetanol) que destrói as pontes dissulfeto, e SDS para desnaturar a proteína agindo ainda na separação das cadeias polipeptídicas isoladas.

O SDS confere carga negativa às proteínas, facilitando a separação por peso molecular, essa mobilidade esta relacionada diretamente ao tamanho da proteína. Outro fator que influencia na mobilidade ante ao gel, é o tamanho dos poros do mesmo. Para melhor resolução de peptídeos de pesos moleculares abrangendo uma faixa maior, é comum a utilização de gradiente do gel, de 5% a 20%, por exemplo. Desse forma, as proteínas grande ficaram retidas no início da corrida e os pequenos peptídeos irão migrar até o final do gel na eletroforese.

A amostra de proteínas que será aplicada no gel é tratada para estar solubilizada e também é desnaturada com a quebra das pontes dissulfeto, forças eletrostáticas e pontes de hidrogênio. Na solução de tratamento da amostra podem ser utilizados agentes dissociantes (Uréia, EDTA), redutores (2-mercaptoetanol, ditiotreirol) e detergentes aniônicos (SDS, desoxicolato de sódio) e, em algumas situações, detergentes não-aniônicos são utilizados (Tween 20, Triton X-100). A amostra também é aquecida em banho até fervura por 5 minutos, geralmente, para garantir a melhor discriminação dos componentes da mistura.

Na solução de amostra também é adicionado glicerina, que irá facilitar a penetração da amostra no gel, e como marcador de corrida é utilizado o corante azul de bromofenol. A coloração do gel tem por finalidade a identificação da composição de proteínas e peptídeos. A coloração realizada pelo Coomassie blue detecta facilmente concentrações da ordem de 10 ng e a realizada por nitrato de prata é mais sensível, detecta até 0,1 ng, sendo irreversíveis as duas colorações citadas.

Conforme o princípio da eletroforese, as frações anitgênicas sofrem ação de carga elétrica, migrando para o pólo positivo. Conforme já sabido, as proteínas de menor tamanho migram com maior velocidade que as proteínas de tamanho maior, pela barreira física estabelecida pelo sistema do gel.

Uma vez separadas pelo tamanho, a posição das proteínas é definida por comparação à migração de um padrão de moléculas de tamanho molecular conhecido. Dessa forma, é possível determinar com precisão o tamanho molecular de proteínas entre 5 e 250 KDa.